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检验精斑方法

2024.04.16 | 成之嘉基因 | 10次围观

检验精斑方法

大部分医院是没有做DNA亲子鉴定的,但是当地的亲子鉴定中心可以做》》》点击获取当地中心地址电话

一、怎么检验精斑

在某些平台上看到一些人提问:紫外线检查灯能直接检查出精斑么?这个答案是否定的。以下是检查精斑的方法,不通的方法检测的程度不一样,可以根据自己的实际情况所需,采取不用的方法!

一:肉眼观察和紫外线检查

1.1肉眼观察

在暗色布质上,精斑浓厚时,呈灰白色,似浆糊状,稀薄时不易察见;在白色布质上,呈黄白色,边缘较中间明显;以手触之有硬感。用放大镜观察,可在表面或布纤维中见黄白色鳞状小片。

1.2紫外线检查

UVA紫外线,即长波紫外线,选用365nm波长。精液/斑在这种紫外线检查灯下回呈现银白色荧光,同样人体其他分泌物,例如:液斑、尿斑、阴道分泌物、乳汁、鼻涕等和肥皂、浆糊斑、某些药物、化学纤维制品,在紫外线检查灯灯照射下也可显现与精斑相类似的荧光。所以在紫外线检查灯下出现银白色荧光,不是精斑的特异性反应,不能作为是精斑的根据。但是如果确认了是精液/精斑,特别是净水洗涤后肉眼看不出任何物质的情况下,借助紫外线检查灯,依然可以见点状荧光来确定精斑所在部位。“荧鸿”刑警检查灯系列,有这种紫外线检查灯

二:化学及生物化学检查

2.1结晶试验

精斑中卵磷脂逐渐析出胆碱,胆碱遇碘则形成过碘胆碱结晶。剪取可疑斑痕少许,置于玻片上,加试剂(碘化钾1.65克、碘2.54克、加水30毫升)1—2滴加盖玻片镜检,初见褐色颗粒,逐渐演变成针状结晶,然后则为褐色菱形结晶,结晶不稳定,于生成后1—3小时可消失。此结晶并非精斑特异性反应,凡含有胆碱的物质(阴道粘液、子宫分泌物、脓液、鼻涕、唾液以及肝、肾等脏器)也可形成结晶。因此,检见结晶只能推断是精斑的可能,而不能确定就是精斑。

2.2酸性磷酸酶试验

因为精液中含有大量酸性磷酸酶,而且所含酸性磷酸酶浓度显著高于其他体液。而酸性磷酸酶.在合适的温度环境与酸性溶液中,可分解磷酸苯二钠,释放出酚。酚经氧化剂铁氰化钾的作用,与氨基安替比林结合,产生红色酮类化合物,随检材中精斑的不同浓度而呈深浅不同的红色,浓度过高,可出现红色沉淀;阴性反应为橙黄色。精液稀释至2万倍,仍可呈阳性反应。如果酸性磷酸酶浓度大于300单位/毫升,可推定为精斑,大于500单位/毫升,可靠性更大。

三:形态学检验

人的精于为蝌蚪状,正规平面呈椭圆形,侧面呈梨形,中间部呈圆柱状,尾部细长。精斑中的精子不易破坏,较牢固地附着在纤维基质上。检验时需将检材用生理盐水浸软,细心分离布纤维,待自然干燥后,固定2—3分钟,用苏木素——伊红染色2—5分钟,镜检。如有精子即被染色,精于正规的后半部(即核)染成蓝色,前半部不着色或浅染,精于中间部及尾部染红色。有条件的也可用扫描电镜检查精子,检材用缓冲液浸渍后,不需染色,即可检出精子。

四:血清学检验

用人精液注射家兔,制备抗人精液免疫血清,用此抗血清与检材浸出液作沉淀反应,阳性反应表明检材含有人的精斑。本法灵敏度较高,检出率远比精子检出法为高,对无精子精液或输精管结扎后的精液更具有实用价值。

检验步骤是:一般经紫外线检查灯检查,确定要检查的物质的范围,用盐水浸出后,离心(2500/分)5分钟,取上清液作抗人精液沉淀反应,用沉渣涂片染色寻找精子,两者均呈阳性便可确定为人精斑。但陈旧精斑,有时只有沉淀反应为阳性,如果该抗人精液血清具有高度特异性,也可作出结论,关键在于制备高效价的特异性抗人精液血清。如果较为新鲜的精斑,沉淀反应为强阳性,而无精子检见,则可推断嫌疑人精液中无精子或作过输精管结扎术。

操作方法是:取检材盐水浸出液作两种不同稀释度(即浸液、浸液5倍、10倍稀释),与抗人精液沉淀素血清作环状沉淀反应,60分钟内出现沉淀环为阳性反应。同时应作无斑痕的空白对照和已知人精斑浸出液及其他有关斑痕(阴道液斑、血痕等)的盐水浸出液对照。

五:血型检验

精液是一种分泌液,其中含有血型抗原A、B、H等,可用吸收法、热解离法、混合凝集法测定精液斑的血型。

检验方法与血痕的血型检验方法相同。但是,由于精斑血型物质的分泌量不同,非分泌型和O型的反应结果不好别,因此应加作抗H血清凝集反应,以便确定所属血型。有的案件还应提取有关的血液和唾液等进行血型测定,以便对照。

有些精斑为混合斑,单用上述方法亲子鉴定得出的结果,不一定是精斑的血型。例如,罪犯是A型分泌型,被害人为B型分泌型,则混合斑的血型可能是AB型,而不是罪犯的血型。对于这类混合斑的血型测定,应先用电泳法分离精斑和阴道分泌物,然后分别测定精液和阴道分泌物的血型,这样才能作为认定或否定罪犯的依据。

二、如何检验精斑痕迹

:精斑是性犯罪现场中更常见和更重要的生物检材。精斑检验分为精斑的确证检验和后续精斑的个人识别检验。精斑检验可以为侦查提供方向和线索,为协商提供证据,是学检验的重点。大多数传统的精斑检验方法,如酸性磷酸酶检验、碘化钾结晶实验和精斑ABO血型测定等,具有一定局限性。因此寻找快速、灵敏度高、不破坏DNA、适用于微量陈旧和污染检材的精斑检验方法一直是学精斑检验的研究热点和方向。随着技术发展,有研究将免疫荧光染色和激光显微切割技术等生物化学和分子生物学技术应用于精斑检验并取得成功。新一代测序技术不断发展并逐步应用于学的精斑检验的个人识别检测当中,为学精斑检验技术开辟了新的途径。

关键词:性犯罪;精斑检验;个人识别;精斑;DNA;分型;新一代测序

精斑是精液射出于体外后浸润或附着于某些载体上随时间变化逐渐干燥形成的一类生物斑痕斑迹[1]。传统检验方法有光谱法、酶催化法、化学法和传统免疫学法等。光谱法包括交替光源照射法、拉曼光谱法等;酶催化法包括酸性磷酸酶检验、乳酸脱氢酶试验等;化学法包括苦味酸结晶试验和碘化钾结晶试验等;传统免疫学法有前列腺特异性抗原检测。这些方法操作简便,但灵敏度和特异性有限,对检材完整性要求高,检验结果不稳定且影响后续DNA检测。现代的精斑检验方法主要分为生物化学方法和分子生物学方法。

1生物化学方法

1.1免疫荧光染色和激光显微切割技术检测目前大多对精子的可视化方法是基于组织学染色,但这些方法对精子并不特异,而且染色会导致DNA损伤。2009年Vandewoestyne等[2]发现一种新的精子染色方法,即使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚等对精子正规进行特异性免疫荧光染色[3],经温自然干燥后,使用激光显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM)切割并捕获荧光标记的精子。该技术是目前更先进、自动化程度更高的组织纯化病理技术,可以精确分离精子和阴道上皮细胞。基于该检测技术目前已研发出成品试剂盒,如Hy-LiterTMPI试剂盒。但是该方法切割精子过程易受设备功率、环境湿度和温度以及精子细胞的数量等因素影响。1.2精液蛋白质质谱技术检测传统的蛋白质组学研究主要是通过双向电泳技术,在检测亲脂性蛋白质、相对分子质量过大或过小和微量蛋白上效果不理想。二维微量高效液相系统(2D-HPLC)、多维蛋白鉴定技术的发展解决了传统方法的局限性,在不破坏DNA结构和节约样本的基础上,可以识别混合物中的特定成份,已应用在唾液和精液检测。精斑检测主要利用精子表面蛋白质质谱、精浆蛋白质质谱和差异蛋白质质谱等进行检测。2013年Yang等[4]用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪检测出48个精液特有蛋白,如精囊蛋白(SEMG1/2)、PSA、前列腺磷酸酶(SAP)、半胱氨酸分泌蛋白等。但是部分蛋白质,如SEMG2等,不存在于无精症患者的精液中,不适用该方法。1.3免疫磁珠法检测通过将特异性的抗体与磁珠进行结合,利用磁性分离技术达到对精液和阴道分泌液混合斑中精子进行捕获和检测。目前,精子特异性抗原对应的单克隆抗体及多克隆抗体的免疫磁珠结合的技术发展也已经很成熟。2011年国内学者利用抗SPAG8抗体和人精子鱼精蛋白抗体成功对精子细胞进行的捕获和分离。免疫磁珠法具备了抗原抗体的较高特异性和其本身的固化性等优点,具有较好的学进行精斑检验的应用前景。

2分子生物学方法

精斑的确证检验和个人识别广泛应用分子生物学方法。其中mRNA、miRNA、DNA甲基化应用于精斑的确证检验,Y染色体遗传标记(Y-STR和Y-SNP)应用于精斑的个人识别。2.1精斑的确证检验2.1.1mRNA检测理论上,由于基因的选择性表达,通过特定基因的mRNA表达进行检测,获得mRNA的表达谱,就可确证相应体液的存在。KLK3和PRM2基因分别在前列腺组织细胞和精子细胞中呈现高水平表达,而在其他组织器官中不表达或少有表达,具有特异性。根据这两个基因的表达情况,可建立通过检测特异性mRNA标记进行精斑检测的方法及标准。该方法具有操作简便、快速,灵敏度高、特异性强等优点,但其与DNA分型技术不兼容。此外,由于RNA不稳定,所以阴性结果也不能排除有精子存在的可能性[5]。2.1.2miRNA检测MicroRNA(miRNA)是一类真核生物体内内源性小分子的单链RNA,长度约为18~25nt,它能通过与靶mRNA碱基配对引起靶mRNA降解或抑制其翻译,从而进行基因表达调控。2009年Hanson等[6]研究发现miR10b和miR135b在精斑中的表达量高于其他体液斑迹,而且在有月经血痕的混合斑和阴道拭子中也有较高水平的表达,可用于精斑确证检验。由于miRNA碱基序列很短,适用于陈旧、易降解的生物检材的检测。但该方法存在miRNA实时荧光定量PCR体系的假阳性率和假阴性率高,耗材昂贵,且与DNA分型技术不兼容等局限性。2.1.3DNA甲基化检测DNA甲基化主要见于CpG二核苷酸的胞嘧啶上,其检测一般在CpG二核苷酸相对集中的域。众多表观遗传学研究表明,通过利用人类基因组中组织特异性DNA甲基化的差异位点(tDMRs)可以对检材来源进行鉴别。2013年AdamWasserstrom等[7]将5个具有精液特异性甲基化差异位点和3个附加作为内部参照位点联合起来,研发出个将tDMRs作为鉴定依据对人体组织或体液样本进行精液斑识别的试剂盒,该方法类似于DNA分型技术。2012年刘峰等[8]采用DNAIQTMSystem试剂盒成功检验了1例精斑。现阶段各类研究筛选的位点数量有限、相关甲基化差异的多态性不高,远不能满足实践中识别生物斑迹类别的需要。因此,未来需筛选更多适用于各种体液鉴定的DNA甲基化差异性标记。2.2精斑的个人识别在学中,精斑及混合斑个人识别检验常用Y染色体遗传标记,包括Y-STR和Y-SNP。此外,新一代测序技术日渐成熟,是目前精斑检验的研究方向和重点。2.2.1Y-STR检测Y-STR在案、轮奸案的混合斑及少精子或无精子的混合斑中男性个体DNA检测具有重要作用。当混合斑中男性精子远低于女性阴道上皮细胞成分时(比例为1∶25~1∶50),以及精液样本存放时间过长、精子拷贝数低、检材发生污染或降解时,Y-STR检测可以排除这些因素对分型结果的影响。1999年Honda等[9]利用4个特异的Y-STR位点,对保存长达25年之久的阴道拭子混合斑检材进行了检测,成功发现了罪犯。在轮奸案中,可利用分型结果一个基因座出现的等位基因个数推知更少作案人数,为案件的侦查提供线索。有研究报道,使用Y-STR检测到多个男性成分的可能性大约是只使用常染色体STR检测的三倍[10]。2.2.2Y-SNP检测Y-SNP位点在人类基因组中分布广泛,数目约比Y-STR位点要高出几个数量级。研究发现,30~60个Y-SNP位点即能达到目前使用的Y-STR位点复合扩增系统的识别率。Y-SNP位点主要用于族源推断,还可用于个体识别。Y-SNP检验手段主要有多重单碱基延伸SNP分型技术(SNaPshot)、飞行时间质谱技术(MassAr⁃ray)、中高通量的SNPstream芯片技术和高通量的二代测序技术(NGS)等。有研究通过DNA微阵列进行SNP分型,发现了Y-SNP芯片,可用于混合斑及精斑的鉴定。但是目前多个Y-SNP位点的检测体系仍在探索中,在日常检测中有局限。2.2.3新一代测序技术DNA测序技术可以检测遗传标记的结构,直观而全面地展示核酸的深次分子生物学信息。在混合斑及精斑检验中,利用二代测序对混合DNA进行STR基因座和SNP位点综合测序,通过长度多态性和序列多态性,进而推断混合DNA不同个体来源以及轮奸案中更少作案人数。二代测序技术在过去的二十年里发展迅速,并逐步实现了商业化。二代测序有高通量和成本低等优势,但测序读长较短,且相较于一代测序而言,二代测序时间长。因此,测序读长长、时间短的三代测序应运而生,其不依赖于PCR扩增技术,为单分子测序。面上三代测序平台有美国HeliscopeBioScience公司的SMS技术和美国PacificBioscience的SMRT技术,Vi⁃siGenBiotechnologies公司的FRET技术以及英国ONT公司所推出的纳米孔单分子测序技术。

3展望

在性犯罪案件中,精斑作为实践中常见的生物检材,其检验结果可以为侦查提供线索,为协商提供证据。随着技术发展,二代测序的应用成为未来精斑个人识别技术发展的新趋势。虽然现在有很多精斑鉴别新技术,但还需传统检测方法辅助和大量试验。

作者:程媛媛 李树 单位:国内学系

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